液相色譜儀與質譜儀的聯(lián)用

  色譜-質譜聯(lián)機技術結合了色譜對復雜基體化合物的高分離能力與質譜獨特的選擇性、靈敏度、分子量及結構信息于一體，具有廣泛的應用領域。現(xiàn)色譜-質譜主要有氣相色譜-質譜和液相色譜-質譜（HPLC-MS）。氣相色譜-質譜的聯(lián)用技術已趨于成熟，它適于易揮發(fā)、半揮發(fā)性有機小分子化合物的分析。然而據(jù)估計已知化合物中約70%的化合物均為親水性強、揮發(fā)性強的有機物，熱不穩(wěn)定化合物及生物大分子，這些化合物廣泛存在于當前應用和發(fā)展最廣泛、最有潛力的領域，包括生物、醫(yī)藥、環(huán)境等方面，因而液相色譜! 質譜的聯(lián)機顯得更為迫切。液相色譜-質譜的聯(lián)用在20世紀,) 年代以后進入實用階段。與氣相色譜-質譜已取得的成功相比，液相色譜-質譜的聯(lián)用還有些技術難題有待解決，主要是色譜系統(tǒng)各種難揮發(fā)溶劑的排除問題。
  液相色譜-質譜聯(lián)用儀主要由色譜儀、接口、質譜儀、電子系統(tǒng)、記錄系統(tǒng)和計算機系統(tǒng)六大部分組成。混合樣品注入色譜儀后，經(jīng)色譜柱得到分離。從色譜儀流出的被分離組分依次通過接口進入質譜儀。在質譜儀中首先于離子源處被離子化，然后離子在加速電壓作用下進入質量分析器進行質量分離。分離后的離子按質量的大小，先后由收集器收集，并記錄質譜圖。根據(jù)質譜峰的位置和強度可對樣品的成分和其結構進行分析。所采用的色譜儀和質譜儀在基本結構和工作原理上與普通色譜儀和質譜儀無大差別，只是在某些方面有些特殊要求。
  但是，在液相色譜儀和質譜儀聯(lián)用時，還有以下困難需要解決： ①色譜儀與質譜儀的壓力匹配問題。質譜儀要求在高真空［1.33*（10^（-2）-10^(-5)Pa 即10^(-5)mmHg-10^(-7)mmHg］情況下工作，而液相色譜儀柱后壓力約為常壓（760mmHg）。色譜流出物直接引入質譜的離子源時，可能破壞質譜儀的真空度而不能正常工作。
  色譜儀與質譜儀的流量匹配問題。一般質譜儀最多只允許1mL/min-2mL/min氣體進入離子源，而流量為1mL/min的液體流動相氣化后，氣體的流量150mL/min-1200mL/min 489。
  氣化問題。被色譜分離后的樣品必須以氣態(tài)的、未發(fā)生裂解和分子重排的形式進入質譜儀離子源。這就要求色譜流出物在進入質譜儀以前氣化。HPLC的流出物為液體，必須采用不使組分發(fā)生化學變化的方法使之氣化。
  要解決以上矛盾，實現(xiàn)液相色譜儀與質譜儀的聯(lián)機，一般要在兩種儀器之間加入一種稱為接口的連接裝置。接口是色譜-質譜的關鍵部件，它起著除去大量色譜流動相分子、濃集和氣化樣品的作用。接口性能很大程度上決定著色譜! 質譜聯(lián)用儀性能的優(yōu)劣。
  （一）LC-MS聯(lián)機技術
  1. 傳送帶式接口
  傳送帶式接口是將HPLC流出物滴加到運動著的傳送帶上，溶劑被加熱蒸發(fā)掉，樣品由傳送帶送入離子源電離。傳送帶式接口的優(yōu)點是對樣品的收集率和富集率都高。但其缺點卻較多：如色譜展寬，只適于對熱穩(wěn)定的樣品，有記憶效應以及在反相HPLC中有一定的限制等。
  2. 液體直接進樣系統(tǒng)
  當HPLC采用微徑柱時，可以讓柱后流出物直接全部導入質譜儀離子源；當HPLC采用普通內徑柱時，通過分流讓一部分流出物直接進入質譜儀，但樣品利用率低。該法適于不揮發(fā)和熱不穩(wěn)定化合物，可以用于反相HPLC。
  3. 熱噴霧接口
  利用一根似探針的加熱輸送管和特殊設計的離子源，先將流動相加熱蒸發(fā)，再把噴出液滴中的揮發(fā)組分快速蒸發(fā)，在此過程中將電荷轉移至分析物分子中，然后使生成的離子導入質譜系統(tǒng)。用離子源內的燈絲、放電電極，即所謂斷裂電極可以提高離子化效率，除了提供通常的質子化分子離子（或負離子形式中的分子陰離子）給予的分子量信息外，有時還提供結構信息。熱噴霧接口技術被用于分析熱不穩(wěn)定、極性和大的分子，特別是用在藥物、農業(yè)和環(huán)境化學領域及許多基礎學科。
  熱噴霧對待分析物的類型有一定的限制。一般要求分子有一定的極性，而且流動相要有一定量的水。該技術通常在進入MS 的流量為1mL/min 左右時工作最佳，采用柱后加入也適用于微孔徑色譜柱。熱噴霧主要提供分子量信息，而且溶劑加合物或緩沖液成分的出現(xiàn)也使熱噴霧不是一個鑒定未知物的最佳方法。由于熱噴霧譜圖與工作條件關系極大，目前還沒有商品化的熱噴霧MS 譜庫。
  4. 粒子束接口技術
  粒子束LC-MS將LC-MS 分析的應用范圍擴展得比熱噴霧更寬，它還可用于帶電子轟擊和化學電離方式的質譜。粒子束接口將電離過程與溶劑分離過程分開，因此使接口更適合于使用不同的流動相，不同的分析物質，得到不同譜圖信息。
  霧化器用每分鐘幾升的氦氣同軸加到LC流出液，將LC流動相噴成微滴，氣體和液滴混合物通過一個兩極動量分離器除去氦氣，再將液滴中的溶劑蒸發(fā)，然后經(jīng)過一段短毛細管進入加熱的質譜離子源。微粒在此被熱源蒸發(fā)，再用常規(guī)電子轟擊或各種反應氣體的化學電離進行電離，既可用正離子方式也可用負離子方式。
  傳送帶式接口和液體直接進樣系統(tǒng)開發(fā)較早，目前已少用。熱噴霧和粒子束兩種接口設計，缺乏專一性和足夠的靈敏度。在確定化合物時，熱噴霧常不能提供足夠多的碎片。受揮發(fā)性、極性、分子量限制，粒子束不能使非揮發(fā)性化合物電離，不能測定低于10^(-9)G水平的樣品。由于熱噴霧和粒子束質譜的靈敏度不能與液相色譜的紫外檢測器、二極管陣列檢測器相匹配，已不能滿足色譜工作者需求，技術仍需進一步完善。由于早期接口的復雜性、不穩(wěn)定性和靈敏度不高的緣故，1993年出現(xiàn)的大氣壓電離技術有取代熱噴霧、粒子束、快速轟擊質譜等的趨勢。以下就對這種大氣壓電噴霧源和大氣壓化學源作簡要介紹。
  在進行質譜分析時，首先要把樣品分子或原子電離成離子，產(chǎn)生離子的裝置叫離子源。目前比較普遍的是電子轟擊源（EI）和化學離子源（CI）。EI 是在高真空下，用強電子流直接轟擊氣態(tài)樣品，使之發(fā)生電離。EI源重現(xiàn)性好，所得信息量多，但分子離子峰豐度小。CI是利用低壓的樣品氣和高壓的反應氣受電子流轟擊，反應氣首先被打掉電子形成離子，這些離子再接受樣品分子的電子，發(fā)生離子分子反應來完成樣品的離子化的。化學電離屬于軟電離方式，解析圖譜較容易，缺點是重現(xiàn)性差。其它離子化方式還有場電離、場解吸電離、快速原子轟擊電離、二次離子質譜等。
  而一種稱為大氣壓離子化（API）的接口離子化方式目前已發(fā)展成為商品技術，如惠普公司的LC-MSD。大氣壓離子化技術是一類軟離子化方式，適用范圍非常廣泛，常用于代謝研究和大量藥物成分的分析。API技術可分為兩種類型：電子噴霧（API-ES）和化學電離（APCI）。在342 , 1" 中，離子的形成是被測分子在帶電液滴的不斷收縮過程中噴射出來的，即離子化是在液態(tài)下完成的。具體地說，就是經(jīng)液相色譜分離的樣品溶液流入離子源，在N2流下氣化后進入強電場區(qū)域，強電場形成的庫侖力使小液滴樣品離子化，借助于逆流加熱N2，分子離子顆
  粒表面液體進一步蒸發(fā)，使分子離子相互排斥形成微小分子離子顆粒。這些離子可能是單電荷或多電荷，這取決于所得的帶有正、負電荷的分子中酸性或堿性基團的體積和數(shù)量。多電荷離子峰的形成使質量范圍為3000 的四極桿濾過器質譜儀也能檢測到生物大分子的準確分子量。API-ES 比較適應下列樣品的分析：帶多電荷的蛋白質、多肽、寡聚核苷酸（分子量可高達150000），帶單電荷的苯并二氮雜艸卓類和磺化共軛物類以及大多數(shù)聚合物。大氣壓化學源與電噴霧相似，所不同的是通過電暈放電針使溶劑首先離子化，離子化的溶劑與待測分析物發(fā)生離子交換化學反應，使分析物離子化，即對低分子量和中等分子量有機化合物（<1600）而言，APCI是很好的普遍使用的LC-MS。實際分析時，可在兩種方式中選擇切換。
  大氣壓電離技術的出現(xiàn)使LC-MS成為一種靈敏度高（pg 級）、選擇性強、樣品用量少、分析速度快的儀器聯(lián)用分析方法。電噴霧源多電荷的形成使其成為蛋白質生物分子研究領域不可缺少的手段，該法的高靈敏度使生物學家能夠在分子水平上研究蛋白質轉移修飾，如糖基化、磷酸化、二硫鍵、脫酰胺基作用、蛋氨酸或色氨酸的氧化作用等，真正揭示結構與生物功能的關系。化學源對于極性較小的化合物（如烴類、醚類、醛類）也能獲得理想的結果，在有機化合物分析中扮演重要角色，特別是在藥物分析，從原材料篩選、生產(chǎn)過程中質量控制、到成品純度鑒定及藥物毒理、臨床等領域都展現(xiàn)了一定的使用潛力。

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